Kloning dan Ekspresi Klenow-Like Fragment DNA Polimerase Termostabil Kelompok Archaea

Abstract

Gen DNA Polimerase termostabil dari kelompok Archaea (polB) utuh berukuran 2,7 kb diperoleh dari hasil pendekatan metagenom. Gen polB diamplifikasi menggunakan pasangan primer Rexp1 (primer reverse) dan primer K8exF (primer forward) sehingga menghasilkan klenow-like fragment polUPER1 berukuran 2 kb dengan dua situs pemotongan enzim restriksi. Klenow-like fragment polUPER1 dan vektor plasmid pET-30a(+) dipotong menggunakan enzim restriksi NdeI dan SalI, kemudian diligasi menggunakan enzim T4 DNA ligase sehingga dihasilkan plasmid rekombinan. Selanjutnya, plasmid rekombinan diklon dengan ditransformasi ke dalam E. coli TOP10 menggunakan metode heat shock. Pada transforman dilakukan seleksi ukuran plasmid, isolasi plasmid rekombinan, dan penentuan ukuran DNA sisipan. Elektroforegram amplikon plasmid rekombinan menunjukkan pita berukuran sekitar 2 kb, diduga sebagai klenow-like fragment polUPER1. Plasmid rekombinan berisi DNA sisipan 2 kb diekspresikan ke dalam E. coli BL21. Kondisi optimum produksi protein DNA polimerase UPer1 ditentukan dengan optimasi ekspresi menggunakan variasi waktu induksi selama 0-6 jam dan variasi penambahahan Isopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) sebagai induser dengan konsentrasi 0,5 mM, 0,66 mM, 1 mM, dan 5 mM. Hasil penelitian menunjukkan protein DNA Polimerase UPer1 berukuran sekitar 50 kDa, diproduksi secara optimum pada waktu induksi selama 5 jam dan penambahan IPTG 0,66 mM.